日本二十六聖人（にほんにじゅうろくせいじん）とは慶長元年12月19日（グレゴリオ暦1597年2月5日）、豊臣秀吉の命令によって長崎で処刑された26人のカトリック信徒。日本でキリスト教の信仰を理由に最高権力者の指令による処刑が行われたのはこれが初めてであった。26人は後にカトリック教会によって聖人の列に加えられたため、彼らは「日本二十六聖人」と呼ばれることになった。二十六人のうち、日本人は二十名、スペイン人が四名、メキシコ人、ポルトガル人がそれぞれ一名であり、すべて男性であった。この出来事を「二十六聖人の殉教」という。祭日は2月5日。
当時は、キリシタン大名やキリシタンによって、寺社が焼かれたり僧侶が迫害されたり、逆に仏教を厚く信仰する大名の元ではキリシタンが迫害される事件が相次いでいた。さらに宣教師や商人によって日本人が奴隷として海外に売られる事件が発生し、ここに至って豊臣秀吉はバテレン追放令を発布した。ただし、秀吉は南蛮貿易の実利を重視していたため、この時点では大規模な迫害は行われなかった。黙認という形ではあったが宣教師たちは日本で活動を続けることができたし、キリシタンとなった日本人が公に棄教を迫られる事はなかった。
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しかし、1596年10月のサン＝フェリペ号事件をきっかけに、秀吉は1596年12月8日に再び禁教令を公布した。また、フランシスコ会の活発な活動が禁教令に対して挑発的であると考え、京都奉行の石田三成に命じて、京都に住むフランシスコ会員とキリスト教徒全員を捕縛して処刑するよう命じた。ちなみに、二十六聖人のうち、フランシスコ会会員とされているのは、スペインのアルカンタラのペテロが改革を起こした「アルカンタラ派」の会員達であった。大阪と京都でフランシスコ会員7名と信徒14名、イエズス会関係者3名の合計24名が捕縛された。三成はパウロ三木を含むイエズス会関係者を除外しようとしたが、果たせなかった。
24名は、京都・堀川通り一条戻り橋で左の耳たぶを切り落とされて（秀吉の命令では耳と鼻を削ぐように言われていた）、市中引き回しとなった。